Baicalein từ cây hoàng cầm giúp chống lại virus đốm trắng WSSV

Trong các loại hợp chất tự nhiên được sử dụng trong NTTS, các loại thảo dược có ưu điểm là ít độc, giá rẻ, ít tác dụng phụ và ít gây kháng thuốc. 

Bên cạnh đó, các loại này có chứa nhiều thành phần hoạt tính, bao gồm dầu dễ bay hơi, polysacarit, tanin, alkaloid, axit hữu cơ, flavonoid và các chất dinh dưỡng như vitamin, khoáng chất, carbohydrate và axit amin.

Do đó, nhiều loại thảo mộc và chất chiết xuất của chúng có thể mang lại khả năng kháng vi-rút và không có tác dụng phụ đối với động vật thủy sản. 

Ví dụ, Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) từ chiết xuất trà xanh đã can thiệp vào sự gắn kết của reovirus với thụ thể laminin (Wang và cộng sự, 2016; Wang và cộng sự, 2018). Magnolol và honokiol (thành phần chính của Magnolia officinalis) đã tăng cường phản ứng miễn dịch của tế bào thận cá trắm cỏ Ctenopharyngodon idella và do đó ức chế sự sao chép của GCRV (Chen et al., 2017). Saikosaponin D (6 mg/kg) có nguồn gốc từ Bupleurum falcatum đã làm tăng 36% tỷ lệ sống của cá ngựa vằn bị nhiễm SVCV (Shen và cộng sự, 2019). Chiết xuất thô của Clinacanthus nutans có hoạt tính kháng cyprinid herpesvirus 3 hiệu quả trên cá chép Koi (Haetrakul et al., 2018). 

Tương tự, naringenin điều chỉnh các gen liên quan đến miễn dịch, các yếu tố liên quan đến chống viêm và tiền chết theo chương trình để ức chế sự sao chép của WSSV (Sun và cộng sự, 2021). Coumarin tăng cường khả năng miễn dịch bẩm sinh (điều chỉnh tăng mức độ biểu hiện của proPO, JAK, STAT, ALF và Hsp70) ở Cherax quadricarinatus để giảm số lượng bản sao của WSSV (Zhou và cộng sự, 2022). 

Nghiên cứu mới đây của nhóm tác giả đến từ Đại học Ninh Ba (Trung Quốc) đã tiến hành đánh giá khả năng kháng virus đốm trắng của tôm thẻ chân trắng được cho ăn bổ sung chiết xuất từ một số loại thảo dược mới.

Mười loại thuốc thảo dược đã được lựa chọn chiết xuất bằng nước và ethanol. Theo đó, 300 mL nước siêu tinh khiết hoặc ethanol đã được thêm vào 50 g bột thảo dược khô và hòa tan bằng cách siêu âm trong 10 phút, sau đó đun ở 60°C trong 30 phút. 

Quá trình này được lặp lại ba lần, với 150 mL nước siêu tinh khiết hoặc etanol được thêm vào sau mỗi chu kỳ. Chất lỏng được lọc qua giấy lọc để thu được dịch lọc, sau đó được cô đặc và làm bay hơi dưới áp suất giảm trong thiết bị cô quay chân không để thu được dịch chiết đông đặc. Dịch chiết nước và etanol được hòa tan trong DMSO để thu được dung dịch gốc 50.000 mg/L. 

Sau đó, Ấu trùng tôm được nuôi tạm thời trong các đĩa 6 giếng, 10 ấu trùng mỗi giếng và ngâm trong các nồng độ chiết xuất thảo dược khác nhau (từ 1 đến 200 mg/L) hoặc DMSO ba lần. Nồng độ tối đa mà tại đó tỷ lệ sống của ấu trùng tôm là 100% trong vòng 3 ngày được xác định là nồng độ an toàn. Tôm chết được vớt ra kịp thời để tránh làm suy giảm chất lượng nước. Nồng độ an toàn của chiết xuất thảo mộc đối với ấu trùng tôm được trình bày trong Bảng S2. 

Kết quả của Hình 1A trình bày tác động của từng chất chiết xuất từ thảo dược thô đối với tỷ lệ sống của ấu trùng tôm bị nhiễm WSSV ở nồng độ an toàn. Chiết xuất ethanol của cây hoàng cầm cho thấy hiệu quả bảo vệ cao nhất đối với ấu trùng tôm nhiễm WSSV là hơn 50%. 

Sau đó, số lượng bản sao WSSV đã được định lượng trong nhóm thử nghiệm; ứng dụng đã cải thiện tỷ lệ sống của tôm bị nhiễm WSSV hơn 30%. Tỷ lệ ức chế đối với chiết xuất nước của Fructus mume, chiết xuất ethanol của Fructus mume, chiết xuất nước của Houttuynia cordata, chiết xuất nước của Xanthium sibiricum, chiết xuất ethanol của Xanthium sibiricum và chiết xuất ethanol của S. baicalensis, được đo bằng giảm số lượng bản sao WSSV lần lượt là 53%, 55%, 61%, 54%, 60% và 73% (Hình 1B). 

Dựa trên những kết quả này, chiết xuất ethanol của cây hoàng cầm được xác định là một loại thuốc thảo dược tiềm năng chống lại WSSV.

Hình 1: Hoạt tính chống WSSV của chiết xuất thảo dược và baicalein

- (A) Tỷ lệ sống của ấu trùng tôm được ngâm cùng với WSSV và chiết xuất thảo dược trong 72 giờ.

- (B) Ức chế số lượng bản sao của WSSV trong ấu trùng tôm bằng chiết xuất thảo dược Trung Quốc.

- (C) Đường cong phản ứng liều sáu điểm xác nhận cho các hoạt động chống WSSV của baicalein. Sự ức chế số lượng bản sao của WSSV được thể hiện bằng hình thoi và tỷ lệ sống của tôm bị nhiễm WSSV được thể hiện bằng hình tròn. Mỗi giá trị được biểu thị dưới dạng trung bình ± SD.

Đối với thử nghiệm invitro về độ kháng với virus đốm trắng, ấu trùng tôm được nuôi tạm thời trong các đĩa sáu giếng trong khi ngâm trong chiết xuất thảo mộc (ở nồng độ an toàn) và WSSV (nồng độ bản sao cuối cùng là 1,6 × 105 bản sao/μL) trong 72 giờ (Liu và cộng sự, 2021; Shan và cộng sự, 2021a). 

Tỷ lệ sống của ấu trùng tôm được quan sát trong khoảng thời gian 12 giờ. Một nhóm thử nghiệm có tỷ lệ sống >30% ấu trùng tôm sau 72 giờ đã được chọn và chạy qPCR để xác định số lượng bản sao DNA bộ gen của WSSV. 

Kết quả cho thấy quá trình ngâm baicalein cho ấu trùng tôm trong cả 4 và 8 giờ đã làm giảm đáng kể số lượng bản sao của WSSV, trong khi SBEE yêu cầu thời gian tới 8 giờ (Hình 2A). Khi được ngâm trước trong 8 giờ, baicalein và SBEE đã ức chế số lượng bản sao WSSV lần lượt là 46% và 31% (Hình 2A). 

Kết quả này gợi ý rằng baicalein và SBEE có thể có vai trò trong việc tăng cường phản ứng miễn dịch của vật chủ và chúng có tiềm năng được phát triển thành chất tăng cường miễn dịch.

Hình 2: Đặc tính kháng vi-rút của chiết xuất etanol của Scutellaria baicalensis (SBEE) và baicalein

- (A) Ấu trùng tôm bị nhiễm WSSV sau khi ngâm với SBEE hoặc baicalein trong 1, 4 và 8 giờ tương ứng.

- (B) Ấu trùng tôm bị nhiễm WSSV trong 6 giờ trước khi được ngâm trong SBEE hoặc baicalein.

- (C) WSSV đã được ngâm trước với SBEE hoặc baicalein trong 1, 2 và 3 giờ trước khi lây nhiễm sang ấu trùng tôm.

Đối với thử nghiệm baicalein, nồng độ an toàn của hợp chất này được xác định như trên. Sau đó, chúng tôi tiến hành ngâm đồng thời ấu trùng tôm trong baicalein (1, 2,5, 6,3, 16, 40 và 100 μM) và WSSV (1,6 × 105 bản sao/μL) ở 28°C. Tỷ lệ sống được ghi lại hàng ngày và ấu trùng tôm được thu thập sau 72 giờ để định lượng mức độ vi rút bằng qPCR. 

Kết quả cho thấy, SBEE hoặc baicalein làm giảm đáng kể số lượng bản sao vi rút ở ấu trùng tôm bị nhiễm WSSV ở 24, 48 và 72 giờ (Hình 2 B). Điều này cũng chứng minh rằng SBEE và baicalein có thể ức chế sự sao chép của WSSV và chúng có tiềm năng điều trị. Khi một đợt bùng phát WSD xảy ra, tác dụng điều trị của SBEE và baicalein có thể làm giảm thiệt hại kinh tế. 

Đối với thí nghiệm đặc tính kháng vi-rút của chiết xuất etanol của cây hoàng cầm Scutellaria baicalensis (SBEE) và baicalein, ấu trùng tôm đã được ngâm trước với SBEE hoặc baicalein trong 1, 4 hoặc 8 giờ. SBEE hoặc baicalein sau đó đã bị loại bỏ và độ pha loãng WSSV (1,6 × 105 bản sao/μL) đã được thêm vào. (b) Để đánh giá hiệu quả tiêu diệt trực tiếp của SBEE hoặc baicalein đối với WSSV, WSSV (8 × 107 bản sao/μL) đã được ngâm cùng với SBEE (200 mg/L) hoặc baicalein (100 M) trong 1, 2 hoặc 3 giờ. Hỗn hợp này sau đó được pha loãng 50 lần với nước nuôi cấy trước khi ngâm với ấu trùng tôm.

Cuối cùng, tác dụng điều trị của SBEE và baicalein đã được thử nghiệm. Ấu trùng tôm được ngâm trong dung dịch pha loãng WSSV (1,6 × 105 bản sao/μL) trong 6 giờ. Trước khi thêm SBEE hoặc baicalein, dung dịch virus đã được loại bỏ và ấu trùng tôm được rửa bằng nước nuôi ba lần. 

Mỗi thí nghiệm được lặp lại ba lần. Như được hiển thị trong Hình 2C, việc ủ trước các hạt WSSV bằng SBEE hoặc baicalein trong 1, 2 hoặc 3 giờ đã làm giảm đáng kể khả năng lây nhiễm của WSSV. 

Kết quả này tương tự như phát hiện trước đây về các hợp chất đơn phân chống WSSV. Cần phải ủ các hạt WSSV bằng esculin hoặc paeoniflorin trong 6 giờ để giảm đáng kể khả năng lây nhiễm của các hạt vi rút (Hu et al., 2022). Các nghiên cứu này gợi ý rằng các hợp chất nêu trên có thể có một số tác động phá hủy các hạt vi-rút và baicalein có hiệu quả hơn.

Đối với thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của SBEE và baicalein đối với sự lan truyền ngang của WSSV, ấu trùng tôm được ngâm trong dung dịch WSSV (1,6 × 105 bản sao/μl). Ở mật độ 24 hpi, ấu trùng nhiễm WSSV (tôm cho) sống chung với ấu trùng khỏe mạnh (tôm nhận) trong vật chứa 1 L, ngăn cách bằng lưới chắn và SBEE (200 mg/L) hoặc baicalein (100 μM) đã được thêm vào mỗi giếng. Ấu trùng tôm nhận được thu thập tại mỗi thời điểm để phát hiện số lượng bản sao WSSV bằng qPCR. 

Kết quả của nghiên cứu này chỉ ra rằng SBEE và baicalein đã ngăn chặn đáng kể sự lây lan theo chiều ngang của WSSV ở 1, 3 và 5 ngày, nhưng không được ghi nhận ở 7 ngày (Hình 3). 

Điều này có thể là do hiệu quả kháng vi-rút của SBEE và baicalein trong nước nuôi trồng thủy sản ngày càng giảm dần (Hình 4). Ngoài ra, so với SBEE, baicalein có khả năng ngăn chặn WSSV theo chiều ngang tốt hơn.

Hình 3: SBEE và baicalein chặn đường truyền ngang của WSSV. Ấu trùng tôm nhận được thu thập cho qPCR lần lượt là 1, 3, 5 và 7 ngày. Mỗi giá trị được biểu thị dưới dạng trung bình ± SD

Đối với thí nghiệm đánh giá tính ổn định của SBEE và baicalein trong nước, SBEE (400 mg/L) và baicalein (200 μM) đã được điều chế trong nước nuôi (nước nuôi dùng để nuôi tôm) và giữ ở 28°C trong 0–4 ngày. 

Tại mỗi thời điểm, ấu trùng tôm được ngâm trong WSSV (1,6 × 105 bản sao/μL) và dung dịch SBEE/baicalein đã xử lý (nồng độ cuối cùng 200 mg/L hoặc 100 μM) trong 72 giờ. 

Như được hiển thị trong Hình 4A, không có sự khác biệt đáng kể về tác dụng kháng vi-rút giữa SBEE trong vòng hai ngày sau khi bổ sung vào nước nuôi. Khi SBEE được để lại trong 0, 1, 2, 3 và 4 ngày trong nước nuôi, tỷ lệ chết cộng dồn của ấu trùng tôm lần lượt đạt 100% ở 120, 120, 120, 96 và 96 giờ (Hình 4B). Dữ liệu trong Hình 4 chỉ ra rằng hoạt tính kháng vi-rút của baicalein ổn định trong nước nuôi cấy trong một ngày. 

Điều này đã được xác nhận bởi các kết quả được hiển thị trong Hình 4D, trong đó chỉ có hai nhóm thử nghiệm, 0 và 1 d, có tỷ lệ chết tích lũy là 100% sau 120 giờ. Kết quả chỉ ra rằng SBEE ổn định hơn trong nước nuôi cấy so với baicalein.

Hình 4: Phân tích về sự ổn định liên quan của SBEE và baicalein trong nước

- (A và C) SBEE hoặc baicalein được hòa tan trong nước và đặt ở 28°C trong 0–4 d. Ấu trùng tôm được ngâm với WSSV và dung dịch SBEE hoặc baicalein ở trên, sau đó là xét nghiệm qPCR.

- (B và D) Đường cong tỷ lệ chết cộng dồn của ấu trùng tôm nhiễm WSSV. Mỗi giá trị được biểu thị dưới dạng trung bình ± SD.

Đối với thí nghiệm đánh giá hiệu quả kháng vi-rút của mô hình thay thế liên tục, ấu trùng tôm được ngâm trong dung dịch pha loãng WSSV (1,6 × 105 bản sao/μL) trong các đĩa 12 giếng. Ở 24 hpi, ấu trùng tôm bị nhiễm WSSV được đặt vào đĩa 12 giếng mới chứa SBEE (200 mg/L) hoặc baicalein (100 μM). 

Sau đó, ấu trùng tôm được thả vào một đĩa 12 giếng mới với nước nuôi sạch trong khoảng thời gian 24 giờ và một liều SBEE hoặc baicalein mới được áp dụng trong bốn ngày nữa. Tỷ lệ chết của ấu trùng tôm được ghi lại và số lượng bản sao của vi rút trong ấu trùng tôm được đo trong khoảng thời gian 12 giờ. 

Trong trường hợp không thay đổi thuốc, số bản sao của vi rút trong ấu trùng tôm bị nhiễm WSSV đạt mức tối đa sau 72 giờ và tỷ lệ tử vong tích lũy đạt 100% sau 72 giờ. Số lượng bản sao vi rút ở nhóm WSSV-SBEE/baicalein luôn thấp hơn so với nhóm WSSV và thời gian để tỷ lệ chết cộng dồn 100% được kéo dài đến 108/120 giờ. Thay đổi thuốc liên tục đã tăng cường hơn nữa tác dụng chống vi-rút của SBEE và baicalein. Số lượng bản sao vi rút trong nhóm WSSV-SBEE/baicalein đạt đỉnh sau 96 giờ trong quá trình thay đổi thuốc liên tục và sau đó có xu hướng giảm. Baicalein hiệu quả hơn SBEE và điều này được hỗ trợ bởi kết quả thể hiện với tỷ lệ tử vong tích lũy là 75% sau 120 giờ ở nhóm WSSV-SBEE và 55% sau 120 giờ ở nhóm WSSV-baicalein.

Đánh giá tác dụng kháng vi-rút của SBEE và baicalein đối với tôm trưởng thành, nhóm tác giả đã sử dụng đầu micropipette 200 μL vô trùng để đưa virion WSSV vào phần miệng của tôm (được đưa vào phần miệng sâu 0,5 cm) và mỗi con tôm được cho ăn 80 μL chất cấy (1,6 × 106 bản sao/μL ). Tôm ăn vi-rút được giữ thẳng đứng trong 30 giây để ngăn chất cấy thải ra từ miệng. Sau 12 giờ, tôm trưởng thành bị nhiễm WSSV được cho ăn bằng SBEE (1 mg/kg) hoặc baicalein (0,5 mg/kg) bằng đường uống.

Các phương pháp thử nghiệm và lấy mẫu cụ thể đã được thực hiện như mô tả trước đây (Shan và cộng sự, 2022). Kết quả chỉ ra rằng số lượng bản sao bộ gen của WSSV đã giảm đáng kể khi xử lý bằng SBEE hoặc baicalein sau 72 giờ (Hình 5A). Đồng thời, SBEE và baicalein đã giảm một cách hiệu quả tỷ lệ chết của tôm trưởng thành bị nhiễm WSSV lần lượt là 20% và 30% (Hình 5B). 

Ngoài ra, RT-qPCR đã được thực hiện để phát hiện sự biểu hiện của các gen liên quan đến miễn dịch ở tôm. So với nhóm WSSV, tất cả biểu hiện gen đã được điều chỉnh tăng đáng kể trong nhóm WSSV+SBEE và WSSV+Baicalein, rằng SBEE và baicalein đã tăng cường phản ứng kháng vi-rút (Hình 5C và D). SBEE và baicalein không ảnh hưởng đến tỷ lệ sống của tôm (Hình 5B).

Hình 5: Tác dụng kháng vi-rút của SBEE và baicalein ở tôm trưởng thành

- (A) Số bản sao bộ gen của WSSV đã được qPCR kiểm tra ở tôm trưởng thành được lấy mẫu.

- (B) Đường cong tỷ lệ chết cộng dồn của tôm trưởng thành bị nhiễm WSSV khi điều trị bằng SBEE hoặc baicalein.

- (C và D) Phản ứng kháng virus của tôm trưởng thành khi có hoặc không có SBEE/baicalein khi nhiễm WSSV. Mức RNA tương đối của các gen liên quan đến miễn dịch ở tôm trưởng thành được lấy mẫu được xác định bằng RT-qPCR ở 72 hpi. Mỗi mẫu được chạy ba lần chuẩn hóa thành tôm EF1α.

Trong nghiên cứu này, chất chiết xuất trong nước và trong etanol của mười loại thảo dược đã được sử dụng để đánh giá hoạt tính chống WSSV. Trong số này, SBEE được coi là một ứng cử viên chống WSSV hiệu quả.

Hơn nữa, baicalein, hoạt chất chính của cây hoàng cầm S. baicalensis, có hoạt tính chống WSSV tốt hơn. Những kết quả này chỉ ra rằng SBEE và baicalein có thể điều chỉnh tăng sự biểu hiện của các gen liên quan đến miễn dịch của vật chủ và do đó có hoạt tính chống WSSV cao.

Do đó, cây hoàng cầm dự kiến sẽ được sử dụng làm phụ gia thức ăn và baicalein có thể được phát triển như một loại thuốc chống WSSV để chống lại sự bùng phát của bệnh đốm trắng trong nuôi tôm.